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Tra il 1439 e il 1444, l’eremo fu sostituito da una chiesa a navata unica absidata e da un monastero annesso.
Gli affreschi, presenti nella chiesa, datano dal 1513 e furono completati nel 1588, ad opera di Bernardino di Betto (1452-1513), detto il Pinturicchio e di Baldassarre Peruzzi (1568-1640).
Nel 1517, Leone X (Giovanni de´ Medici – 1513-1521) elesse la chiesa a titolo cardinalizio diaconale.
Nel 1568 Pio V (Antonio Michele Ghislieri – 1566-1572) impose nuove costituzioni ai monaci di Sant’Onofrio che presero i solenni voti sacerdotali e aderirono alla Regola di Sant’Agostino. In conseguenza di ciò, nel 1588, Sisto V (Felice Peretti – 1585-1590) elesse la chiesa a titolo cardinalizio presbiteriale ed aprì la strada che conduceva in Vaticano (oggi Salita di Sant’Onofrio).
Per l’anno giubilare, del 1600, Clemente VIII (Aldobrandini - 1592-1605) pavimentò la Salita di Sant´Onofrio, mentre furono dipinte le lunette del chiostro del convento dal Cavalier d’Arpino (1568-1640) e quelle del portico da Domenico Zampieri (1581-1641), detto il Domenichino.
Nel 1620, la famiglia Vaini, potente famiglia di origine emiliana, ricavò la propria cappella funeraria murando le prime due campate del portico. La dedica della cappella alla Madonna del Rosario è conseguente alla istituzione di una festa (omonima) nella ricorrenza della vittoria di Lepanto del 1571.
Nel 1712, le spoglie del Beato Nicolò da Forca Palena furono trasportate sotto l’altare maggiore.
Nel 1720, la loggia del portico fu pure tamponata per ricavarne celle per i monaci, sempre più numerosi.
Tra i visitatori illustri del monastero troviamo Torquato Tasso (1544-1595), che vi si rifugiò tre mesi prima di morire e vi fu sepolto Johann Wolfgang von Goethe (1749-1832) durante il suo viaggio in Italia dal 1786 al 1788 e Marie-Henri Beyle (1783-1842), noto come Stendhal, nel 1815.
Durante la Repubblica romana, del 1849, il complesso di Sant’Onofrio fu al centro dei combattimenti tra garibaldini e truppe Francesi.
Nel 1869, su iniziativa della famiglia Salviati, viene creato, presso il monastero, un ospedale pediatrico dedicato al “Bambin Gesù”.
Nel 1873 il Governo Italiano espropriò il convento/ospedale, mentre i monaci girolamini mantennero il possesso della chiesa.
Nel 1929, in seguito ai Patti Lateranensi, i monaci recuperarono il convento/ospedale, ma nel 1935 i monaci girolamini erano rimasti così in pochi e in età avanzata che Pio XI (Ambrogio Damiano Achille Ratti - 1922-1939) li collocò presso altre congregazioni sopprimendo, per estinzione, la congregazione dei Gerolamini fondata nel 1377 da Pietro Gambacorta da Pisa (1355-1435).
Nel 1945, il complesso fu concesso all’Ordine Equestre del Santo Sepolcro che, a sua volta, affidò la gestione liturgica della chiesa ai “Frati Francescani dell'Atonement” che vi dimorano ancora oggi.
Un nuovo ospedale pediatrico del Bambin Gesù è stato realizzato a fianco del convento, su territorio della Santa Sede.
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