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Nel 1363, donna Margherita Pauli, originaria di Majorca, fondò un altro ospedale per sole donne della sua nazione, nelle vicinanze di San Tommaso degli Spagnoli (oggi dei SS Petronio e Giovanni dei Bolognesi – vedi via del Mascherone), la cui comunità era dedicata a Santa Margherita.
Nel 1475, la cappella di San Niccolò fu ingrandita per farne la sacrestia inglobando la chiesa di Sant’Andrea de Azanesi (XII sec.), che si trovava in angolo tra il vicolo (oggi via) della Barchetta e via Arenula (oggi via Giulia), dietro la chiesa attuale.
Nel 1495, le due comunità, quella di San Niccolò e quella di Santa Margherita, si riunirono, per volere di Alessandro VI (Rodrigo Borgia - 1492-1503), in una sola Confraternita dedicata a Santa Maria in Monserrato, con sede in via della Barchetta (vedi via della Barchetta - Regola) volta all’assistenza spirituale e materiale dei sudditi della Corona d’Aragona residenti a Roma.
Nel 1469, era avvenuta l’unione dei regni di Aragona e di Castiglia, dove la Comunità Castigliana era assistita dall’ospedale legato alla chiesa di San Giacomo degli Spagnoli a Piazza Navona e, per un certo tempo, le comunità dei due regni rimasero fedeli ai rispettivi centri di assistenza.
Nel 1518, la Confraternita di Santa Maria in Monserrato decise di costruire una nuova chiesa, su disegni di Antonio da Sangallo (1484-1546) il giovane, ma i lavori progredirono molto a rilento, tanto che furono portati a termine solo nel 1848, a meno della parte superiore della facciata, che fu ultimata nel 1929.
Il periodo seguente la morte di Alessandro VI (Rodrigo Borgia – 1492-1503) non fu favorevole alla raccolta di offerte per la chiesa aragonese, per reazione ad un governo papale tra i più corrotti e manifestamente attento ai soli interessi di casa Borgia.
La morte del Sangallo determinò un ulteriore rallentamento dei lavori che furono ripresi da una serie di architetti che li realizzarono seguendo il progetto originale del Sangallo e da Francesco Capriani (1535-1594) che eresse la prima parte della facciata.
Nel 1594, la chiesa fu consacrata, con la facciata interrotta al primo piano e l’abside coperta da un’impalcatura di legno.
Solo nel 1675, la Confraternita riuscì a completare l’abside ed a realizzare un nuovo altare maggiore, per opera di Giovanni Battista Contini (1642-1723).
Durante l’occupazione napoleonica di Roma del 1798, le due chiese spagnole furono saccheggiate e chiuse, in modo che, ristabilito il governo del papa (1815), gli spagnoli si trovarono a possedere due chiese in cattive condizioni.
Infatti, nel 1807, le chiese di Castiglia e Catalogna a Roma erano state canonicamente riunite, come conseguenza della nascita (1716) della Nazione Spagnola, che aveva unificato i regni di Castiglia, di Asturia, di Castiglia, di Léon, d'Aragona, di Grenada e di Navarra in un solo territorio, governato da un unico monarca.
Nel 1818, gli Spagnoli vendono la chiesa di San Giacomo degli Spagnoli, a Piazza Navona, alla Congregazione Francese di Nostro Signore del Sacro Cuore e assumono, come chiesa nazionale quella di Santa Maria in Monserrato.
Tra il 1820 e il 1823, intervenne un rifacimento della nuova chiesa nazionale spagnola, in chiave neoclassica, per mano dell’architetto Giuseppe Camporese (1761-1822), seguito dal figlio Pietro Camporese (1792-1873). Della precedente chiesa non lasciarono che le due cappelle laterali centrali, mentre vi furono trasferite una parte delle lapidi e delle suppellettili della chiesa di San Giacomo.
In questa stessa occasione fu costruito il Collegio Spagnolo su via Giulia, immediatamente dietro la chiesa (vedi Via Giulia – Regola).
Nel 1926, fu completata la facciata della chiesa, ad opera di Salvatore Rebecchini (1891-1977). Nel 2003, la chiesa è divenuta Titolo Cardinalizio
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